Free DNA Fetal Kit® RhD

Kit de génotypage fœtal RHD à partir d’ADN fœtal libre du sang maternel

(Technique PCR Temps réel)

Réf. : 502080233

1. L’ALLOIMMUNISATION ANTI-RHESUS D 

L’alloimmunisation anti-Rhésus D (RhD) est responsable, en l’absence de traitement, d’anémies fœtales et néonatales sévères ainsi que d’ictères néonatals graves. Elle correspond, chez la femme RhD négatif, à la synthèse d’anticorps IgG anti-D en réponse au passage transplacentaire d’hématies fœtales RhD positif dans la circulation maternelle. Les anticorps maternels traversant le placenta vers la circulation fœtale provoquent en retour une hémolyse et une anémie chez le fœtus RhD positif.
L’alloimmunisation peut être prévenue par l’administration d’immunoglobulines anti-D.

La connaissance du Rh D fœtal est essentielle :

• Chez les femmes RhD négatif non immunisées pour sélectionner celles qui devront bénéficier d’une immunoprophylaxie ciblée ou systématique,
• Chez les femmes RhD négatif déjà immunisées pour identifier les fœtus à risque d’anémie (fœtus RhD positif) devant faire l’objet d’une surveillance particulière.

Ce kit permet de déterminer le génotype RHD fœtal sur du sang maternel prélevé lors du suivi prénatal des patientes RhD négatif sans nécessiter de prélèvement invasif.

2 - PRINCIPE DU TEST

Il a été démontré que le plasma d’une femme enceinte contient des concentrations d’ADN fœtal faibles mais croissantes avec l’age gestationnel. Cet ADN équivaut à quelques copies jusqu’à plusieurs centaines de copies de génome fœtal par ml de plasma. Chez les femmes enceintes RhD négatif qui ne possèdent pas le gène RHD dans leur génome, il est possible d’identifier ce gène dans l’ADN extrait de leur plasma par une technique d’amplification génique (Brevet Oxford University) si leur fœtus est RHD positif.
La présence du gène RHD fœtal dans l’ADN du plasma maternel est détectée par PCR en temps réel ciblée sur trois régions distinctes du gène RHD : les exons 5, 7 et 10, afin de détecter très spécifiquement le plus grand nombre de variants du gène RHD. Les amplicons sont révélés grâce à des sondes d’hydrolyse spécifiques de chaque exon amplifié.
Des contrôles positif, négatif, blanc, et contrôles d’extraction seront réalisés en parallèle.

3 - COMPOSITION DU KIT 

4 - ELEMENTS NECESSAIRES MAIS NON FOURNIS

* Kit pour extraction d’ADN (et matériel et accessoires associés) :

  
* Réactifs PCR en temps réel :

* Consommables pour thermocycleur PCR en temps réel, avec système capillaires en verre de 20µl, ou avec plaque multi-puits.

* Pipettes et embouts spécifiques à filtre pour PCR.

5 - LIMITES

Ce test a été validé exclusivement pour l’analyse de plasmas humains prélevés sur les anticoagulants EDTA ou ACD. Les échantillons ne doivent pas être collectés sur héparine car il s’agit d’un inhibiteur de la PCR.
Le kit a été développé pour être utilisé conjointement avec la méthode d’extraction décrite dans la notice ainsi qu’avec un thermocycleur de type capillaire pour l’amplification. Il s’agit de la technique de référence ayant fait l’objet de publications et de validations des performances. Les paramètres ont été établis en fonction de l’utilisation de la méthode décrite.
L’extraction se révélant être une étape critique, le recours à d’autres méthodes d’extraction peut réduire le rendement, entraînant ainsi la modification des paramètres d’interprétation, les valeurs de Cp obtenues tant au niveau des contrôles que des échantillons cliniques pouvant varier de une à deux unités. Certaines de ces méthodes ont été évaluées (nous consulter).
Au cours des processus d’amplification qui sont de nature enzymatique, il existe un risque de réduction de l’efficacité de l’amplification si des substances inhibitrices sont présentes dans l’échantillon clinique. L’ADN du standard interne est introduit dans chaque échantillon et sert de témoin d’extraction et d’amplification pour chaque échantillon traité individuellement.
Il est recommandé de ne réaliser ce test que sur des échantillons prélevés à partir de 12 semaines d’aménorrhée (la quantité d’ADN fœtal circulant avant ce terme étant trop faible).
Un génotype RHD fœtal négatif observé sur un premier échantillon de sang maternel prélevé avant 18 semaines d’aménorrhée doit être considéré comme provisoire, il est à confirmer sur un second prélèvement sanguin maternel effectué deux semaines plus tard afin de pallier un résultat faux-négatif.
Un génotype RHD fœtal positif observé sur un premier échantillon de sang maternel peut être considéré comme définitif.
Un résultat faussement positif est néanmoins possible, par contamination pré-analytique ou per-analytique de l’échantillon, ou si l’haplotype fœtal RHD correspond à un variant silencieux.

6 – PERFORMANCES

Une étude réalisée avec le kit première génération Free DNA Fetal Kit® RhD (exons 7 et 10), portant sur 300 échantillons issus de plasmas collectés entre 12 et 36 semaines d’aménorrhée chez des femmes enceintes de phénotype RhD négatif a été effectuée. Les résultats ont été comparés au génotype RHD fœtal déterminé sur liquide amniotique, ainsi qu’à la technique initialement développée  à partir des travaux de C. Rouillac-Le Sciellour et col. au Centre National de Référence en Hémobiologie Périnatale (Paris, France).
Une corrélation de 100%  a été obtenue entre les deux méthodes.
Aucun résultat faux négatif, défini par l’absence d’amplification des deux exons 7 et 10 du gène RHD n’a été trouvé chez les enfants ayant un génotype RHD positif.
Une seconde évaluation portant sur l’analyse de 120 échantillons de plasma, provenant d’une plasmathèque documentée du C.H.I. de Poissy St Germain (étude rétrospective), a été réalisée en utilisant le kit Free DNA Fetal Kit® RhD (exons 5, 7 et 10). Ces échantillons proviennent de femmes enceintes de phénotype RhD négatif, dont cinq sont porteuses d’un gène silencieux. Les résultats ont été comparés au phénotype de l’enfant à la naissance, avec une corrélation de 100%.

7 – GUIDE D’INTERPRETATION